siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究常做的實(shí)驗(yàn)之一，但很多研究者對于siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果的判斷還存在模糊認(rèn)知，以至于無法準(zhǔn)確判定siRNA的轉(zhuǎn)染效率和目標(biāo)基因mRNA或蛋白表達(dá)水平的敲低效果。本文將從siRNA轉(zhuǎn)染陽性率、基因沉默效率和蛋白表達(dá)水平三方面來分析說明如何準(zhǔn)確判斷siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果。

一、siRNA轉(zhuǎn)染陽性率

siRNA轉(zhuǎn)染陽性率一般是通過研究者轉(zhuǎn)染帶熒光標(biāo)記的陰性對照，再用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染進(jìn)siRNA并呈現(xiàn)出點(diǎn)狀熒光的細(xì)胞比例來判斷。觀察前，應(yīng)用PBS清洗兩遍細(xì)胞培養(yǎng)板，將含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基洗去，否則在鏡下觀察時(shí)會因?yàn)闊晒獗尘疤珡?qiáng)而無法清晰看到轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的熒光點(diǎn)。這一點(diǎn)特別重要，很多研究者沒有清洗就去觀察熒光，往往會因?yàn)楸尘疤珡?qiáng)看不到轉(zhuǎn)進(jìn)去的熒光點(diǎn)就誤認(rèn)為沒有轉(zhuǎn)進(jìn)去。還有，如果不進(jìn)行清洗，細(xì)胞表面會吸附熒光標(biāo)記的siRNA和細(xì)小的熒光顆粒，有時(shí)又會導(dǎo)致錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)染陽性判斷。另外，我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，很多沒有顯微鏡使用經(jīng)驗(yàn)的研究者往往調(diào)不好顯微鏡焦距，細(xì)胞內(nèi)盡管有很多熒光點(diǎn)卻觀察不到，常常將轉(zhuǎn)染陽性誤認(rèn)為轉(zhuǎn)染陰性。

需要特別指出的是，siRNA轉(zhuǎn)染陽性率只是判斷siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果的初步指標(biāo)，并不是判斷siRNA轉(zhuǎn)染效果的金標(biāo)準(zhǔn)，判斷siRNA轉(zhuǎn)染效果的金標(biāo)準(zhǔn)無疑是目標(biāo)基因mRNA的敲降水平。顯然，siRNA轉(zhuǎn)染陽性只是表明siRNA被轉(zhuǎn)染進(jìn)了細(xì)胞，無法反映siRNA被轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后能否被有效釋放和產(chǎn)生目標(biāo)mRNA敲降作用的情況。有些研究者出于操作簡單的考慮，僅僅通過siRNA轉(zhuǎn)染陽性率去判斷siRNA的轉(zhuǎn)染效率顯然是錯(cuò)誤的。

特別需要注意的是，在標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞內(nèi)熒光的強(qiáng)弱并不具備判斷意義。有些研究者認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)表示siRNA轉(zhuǎn)染效率高，這是比較錯(cuò)誤的認(rèn)知。事實(shí)上，有些轉(zhuǎn)染試劑如PEI、陽離子脂質(zhì)體類試劑，轉(zhuǎn)染siRNA后胞內(nèi)熒光往往很強(qiáng)很亮，但是在檢測基因沉默效率時(shí)，mRNA的敲降效果卻很低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的機(jī)理是，陽離子脂質(zhì)體或PEI類轉(zhuǎn)染試劑往往帶有較多的正電荷，通過靜電引力吸引了較多的熒光標(biāo)記siRNA，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后由于脂質(zhì)體或PEI不能很快降解，并不能高效地將靜電吸引的siRNA釋放，導(dǎo)致標(biāo)記siRNA聚集，從而使熒光看起來很強(qiáng)。但是，由于不能將siRNA高效釋放，雖然熒光很強(qiáng)，但目的基因mRNA干擾水平卻很低，無法達(dá)到理想的研究效果。因而，研究者以轉(zhuǎn)染的熒光強(qiáng)弱來判斷siRNA轉(zhuǎn)染效果往往會得出錯(cuò)誤的結(jié)論。實(shí)際上，真正高效的siRNA轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)的熒光應(yīng)該是有些折光、分散于細(xì)胞質(zhì)的點(diǎn)狀熒光，RNAiMAX、Starvio siRNA轉(zhuǎn)染試劑等比較高效的轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染結(jié)果均是如此，而Lipo2000、國內(nèi)部分轉(zhuǎn)染試劑呈現(xiàn)的轉(zhuǎn)染結(jié)果基本上都是熒光很強(qiáng)但敲除效率卻不高。

二、基因沉默效率

如上所述，轉(zhuǎn)染陽性率只是一個(gè)直觀的表象指標(biāo)，目的是用來初步判斷轉(zhuǎn)染試劑能否將siRNA轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，但研究者無法通過該數(shù)據(jù)來獲得準(zhǔn)確的siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果。想要準(zhǔn)確判斷siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果還得看“金標(biāo)準(zhǔn)”，即是目標(biāo)mRNA的敲降水平，也稱基因沉默效率。那么，檢測基因的沉默效率需要注意哪些方面呢？

1）細(xì)胞死亡率

“金標(biāo)準(zhǔn)”的可信度和準(zhǔn)確度需要建立在轉(zhuǎn)染后低細(xì)胞死亡率的基礎(chǔ)上，因?yàn)樗劳黾?xì)胞的這部分也會表現(xiàn)為目的基因mRNA表達(dá)水平的降低。因此，研究者需要選擇低細(xì)胞毒性的siRNA轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如RNAiMAX、StarviosiRNA轉(zhuǎn)染試劑等，以規(guī)避試劑毒性對轉(zhuǎn)染結(jié)果帶來的負(fù)面影響。

2）檢測時(shí)間

基因沉默效率的檢測時(shí)間非常重要。研究者最好在siRNA轉(zhuǎn)染后24h~48h之間進(jìn)行檢測，由于細(xì)胞會分裂增殖，對于mRNA敲降水平的檢測結(jié)果有影響，因而檢測時(shí)間最晚不建議超過72小時(shí)。

3）設(shè)置內(nèi)參

RT-qPCR檢測中，合理設(shè)置內(nèi)參十分關(guān)鍵。內(nèi)參能夠有助于使檢測的樣本量中各種影響因素趨于均質(zhì)化，而不會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)過大的偏差。但要注意的是，實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參基因不能是陽性對照所要敲降的基因，如實(shí)驗(yàn)中的陽性對照為siGAPDH，則內(nèi)參要選擇細(xì)胞中其它表達(dá)量穩(wěn)定的管家基因，否則實(shí)驗(yàn)的設(shè)置和結(jié)果就會出現(xiàn)問題，這點(diǎn)可能會被一些實(shí)驗(yàn)者忽略。

三、蛋白水平

siRNA轉(zhuǎn)染后引起目的基因mRNA的降解，繼而影響其蛋白水平的表達(dá)，這是被大家廣泛所認(rèn)知的一個(gè)科學(xué)事實(shí)。分子生物學(xué)的中心法則就描述了這種從DNA到RNA再到蛋白的基因表達(dá)過程：由DNA先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后再翻譯成蛋白的氨基酸鏈。也正是鑒于mRNA和蛋白之間的這種關(guān)系，多數(shù)人都會存在一個(gè)誤解，認(rèn)為目的基因mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平是一致的，所以當(dāng)發(fā)現(xiàn)WB檢測結(jié)果顯示蛋白水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著變化時(shí)就產(chǎn)生了自我懷疑。其實(shí)不然，雖然兩者存在必然的影響關(guān)系，但是并不一定會表現(xiàn)出完全一致的結(jié)果。一方面，在基因表達(dá)的過程中，存在著轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后調(diào)控等多種調(diào)控機(jī)制，甚至細(xì)胞中的信號通路可以通過翻譯后修飾（如磷酸化、泛素化等）來快速改變蛋白質(zhì)的活性，而不必改變蛋白質(zhì)的總量，所以造成蛋白水平高、低或者無顯著變化的原因就可能是多方面的。另一方面，蛋白水平檢測時(shí)間的設(shè)置也非常重要，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔，并且受細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調(diào)控等因素的影響，所以蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關(guān)系。通常情況下，在siRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行WB檢測，但每個(gè)實(shí)驗(yàn)中目的蛋白水平的變化快慢并不相同，研究者可采用多點(diǎn)采樣的方式來監(jiān)測蛋白水平的變化情況，以便于更加詳實(shí)地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。