實時熒光定量（RT-qPCR）想必大家都不陌生，根據其實驗步驟的不同，可以分為“一步法”與“兩步法”。目前來說，兩步法研究者用的比較多，即是將反轉錄和PCR擴增分兩步進行，首先從RNA模板反轉錄得到cDNA，得到的cDNA再進行一次或多次不同的PCR反應。這種方法的最大優(yōu)點是可以保存反轉錄后的cDNA產物，但對于需要對大量樣品進行分析或定量PCR，又或是對防污染要求比較高的研究者來說是不適用的，而一步法RT-qPCR就很好的解決了這類實驗難題。

簡單來說，一步法熒光定量就是逆轉錄和定量PCR在一個反應管內一步完成，使逆轉錄酶與DNA聚合酶在同一管內同樣緩沖液條件下完成反應，整體實驗操作簡便，非常適合于研究生使用。目前，除了像Thermo Fisher此類國際生物試劑品牌，國內的像Starvio也有用下來不錯的一步法熒光定量試劑盒，這些試劑普遍具有以下幾個特點:

1、操作簡單

加樣環(huán)節(jié)少，兩步反應都在一個管中完成，這種方法能克隆微量mRNA而不需構建cDNA文庫，省略了cDNA與qPCR反應之間體系轉換的過程，操作方便快捷，也大大提高了實驗的效率，非常適用于高通量擴增/篩選；

2、減少污染

cDNA合成和擴增之間不需要打開反應管蓋，更少的移液步驟能夠減少污染的風險，同時具有更少的實驗誤差；

3、靈敏度更高

一步法反轉錄得到的所有cDNA都用來擴增，所以相比于兩步法來說靈敏度更高，可高出10倍，且最低可檢測到1 pg總RNA中的目標片段，有些兩步法無法檢測到的數據，用一步法可以檢出。

此外，我們還購買了一款國產品牌的一步法RT-qPCR試劑盒與Starvio的進行了比較，結果如下圖所示，從擴增曲線結果來看，Starvio一步染料法熒光定量PCR試劑盒反應更為靈敏，線性范圍寬，穩(wěn)定性好。

圖1.以人的總RNA為模板，10倍系列稀釋，一步法擴增ubiquitin基因的一個片段，每個反應重復3次。紅線為Starvio一步染料法熒光定量PCR試劑盒的擴增結果，綠線為國內另一品牌供應商的擴增結果。